2019年10月1日，5-羟甲基（jī）化胞嘧啶（dìng）（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿病（bìng）研（yán）究领（lǐng）域（yù）取得重要进展（zhǎn）。2型糖尿病（T2D）的（de）血（xuè）管并发症是导致（zhì）2型糖尿病致残致（zhì）死的（de）重要病因（yīn），一直缺乏一种（zhǒng）无创便捷的临床（chuáng）途径实现血（xuè）管（guǎn）并发症的发（fā）生发展监测，达到早发现、早干预，以提高T2D病人的整（zhěng）体生活质量，减少卫生（shēng）经济负担。

该研究入组了62例（lì）2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中（zhōng）表观遗（yí）传标（biāo）志物5hmC的分（fèn）布情况进（jìn）行检测，分析5hmC标志物与2型糖（táng）尿（niào）病（bìng）血管并发症发生（shēng）发展的相关（guān）性。结果表明5hmC标（biāo）志物（wù）的变（biàn）化与T2D合并大血管/微血管事（shì）件具有相（xiàng）关性，主要涉及（jí）一些与血管生物学和糖尿病（包括胰岛素耐（nài）受和炎症反（fǎn）应）相关的基（jī）因和信号通路（lù）。该研究建立的16个基因-5hmC标志物组合检测可以准确（què）区分有（yǒu）并发症和无并发症（zhèng）的2型糖尿病病人（rén）[实（shí）验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统（tǒng）临（lín）床变量例（lì）如白蛋（dàn）白尿。除此之外，还建立（lì）了（le）13个基因-5hmC标志物组合检测，可以进一（yī）步区分T2D合并（bìng）单一并发症和多（duō）种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其他传统临床变量。该研究得出结论，5hmC标志物反映了T2D病人大血管/微血（xuè）管并发症（zhèng）发生过程中（zhōng）的表观遗传（chuán）变化，因而5hmC-Seal检测技（jì）术在监测（cè）糖（táng）尿病血管并发症发（fā）生和进展方面具（jù）有（yǒu）良（liáng）好的临床应用前景（jǐng）。

本研究共纳入62例2型糖尿病病人，包（bāo）括没有血管并发症（zhèng）的病人12例（lì），有单（dān）一血管并发症的病（bìng）人（rén）34例（24例发生大血管事件，10例发（fā）生（shēng）微血（xuè）管事件），以及有（yǒu）多种（zhǒng）血管并发症的病人16例。试验（yàn）收集62例病人血（xuè）浆，提取cfDNA，利用（yòng）5hmC-Seal技术（shù）捕（bǔ）获外周（zhōu）血cfDNA中的5hmC序列（liè），进（jìn）行二代测序，通过生物信息学分析找出并发症组与无并发症组之间有显著5hmC修（xiū）饰差异的基因（yīn），单一并发症（zhèng）组和多种并发（fā）症组之间有显著5hmC修饰差（chà）异（yì）的基因。随后利用回归模型对差异基因进一（yī）步筛选（xuǎn）、优化，弹性网（wǎng）络进一步筛（shāi）选，计算加权平均分，最后得到一组（zǔ）具（jù）有高度灵敏度和特异性（xìng）的（de）5hmC生物（wù）标记物，并进一步（bù）在实验组中（zhōng）验证，分（fèn）析其灵敏度和特异性。并将新建立的5hmC标志物基（jī）因组合的检测（cè）性能（néng）与传统临床变量进行对比分（fèn）析。最（zuì）后对相关基因进行了（le）信号通路分析和功能探究。

5hmC修饰（shì）水平与血管并发症具有相关性

利用逻辑回归（guī）模（mó）型（xíng）对62例有（yǒu）并发（fā）症和无并发（fā）症2型糖尿病病人的5hmC差异（yì）水平进行分析发现，有并（bìng）发症2型糖尿病病人的622个差异修饰候选基因（包（bāo）括上调和下调基（jī）因）的归一化平均数要明（míng）显高于无（wú）并（bìng）发症的病人（P<0.001），但是单一并发（fā）症和多（duō）发并发症病人之间没有显著（zhe）差异（yì）。

之后将有单一（yī）并发（fā）症或多（duō）种并发症的50例病人用逻辑回归模型进行了（le）对（duì）比，发（fā）现多种并发症的病人的153个差（chà）异修饰候选基因（包括（kuò）上调和下调基因（yīn））的（de）归一化（huà）平均数要（yào）低于无并（bìng）发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分（fèn）有（yǒu）无并发症患者

62例2型糖尿病（bìng）病人被（bèi）随机分（fèn）成训（xùn）练（liàn）组（n=31）和测试组（zǔ）（n=31）。利用（yòng）弹性网络筛（shāi）选后发（fā）现，16基（jī）因-5hmC标（biāo）志物组（zǔ）合检测可以用于区分有（yǒu）并发（fā）症和无并发症的2型（xíng）糖尿（niào）病（bìng）病人。

基于16基因组（zǔ）合模型 (Detection Model 1) 的（de）加权（quán）平均分分析，发现无（wú）并发症病人的分数在训练集和测试集（jí）中都明显低于有并（bìng）发（fā）症的病人。只考虑加（jiā）权平（píng）均分的话，受试者工作特（tè）征（zhēng）曲线（ROC）分（fèn）析表明将（jiāng）cutoff值设置成0.5时，在测（cè）试组中（zhōng）中的灵敏度为60%，特异性（xìng）为100%。

5hmC标（biāo）志物（wù）可区分（fèn）病人是（shì）单一（yī）并发症还（hái）是（shì）多种并发症

50例有并发（fā）症（zhèng）的2型糖尿病病人被随机分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网（wǎng）络筛（shāi）选后发现（xiàn），13基（jī）因-5hmC标（biāo）志（zhì）物组合可以区（qū）分（fèn）2型糖尿病病人是（shì）否发生单一并（bìng）发症或多种并发症（zhèng）。

基于（yú）13基（jī）因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多（duō）种并（bìng）发症的加权（quán）平均分，发现在训练集和（hé）测试集中单一并发症（zhèng）和（hé）多种并发（fā）症（zhèng）病人的分数都有（yǒu）明显差异。值得一提的是，有肾病并发症和无肾病（bìng）并发症病人（rén）的分数也有（yǒu）明显（xiǎn）差（chà）异。利用（yòng）加权平均分作为判断标准的受试者工作特征曲线（ROC）表明，在测试组中当将cutoff值设成0.69时，灵（líng）敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与（yǔ）传统（tǒng）临床变量/危险因子的对比

我（wǒ）们评估了不同临床（chuáng）变（biàn）量/危险因子用于监测血管并发症的灵敏度和特（tè）异性（xìng）（见表1）。

信号（hào）通路分（fèn）析和功能探究

有并发（fā）症和无并发症病人的135个（gè）差异候选基因的功能（néng）注释（shì）分析（xī）表明（míng），这些基因主要富集（jí）在一些经典（diǎn）的信（xìn）号通路。错（cuò）误（wù）发现率相关（guān）P值（zhí）位（wèi）于前10%和基（jī）因数目≥3的信号通路包括（kuò）由（yóu）IGF1R, IL-10和（hé）FGFR2所介导的信号通路（lù）。由IGF1R和（hé）IL-10介导的信（xìn）号通路与胰岛素抵抗（kàng）及炎症反应相关，在血管生（shēng）物学和（hé）糖尿（niào）病（bìng）发生发展过程中发挥重要作用（yòng）。

Reactome相互作用（yòng）网（wǎng）络的中（zhōng）心表明（míng），泛素编（biān）码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚（yà）基核糖体蛋白（bái）融合产物1(UBA52)]是（shì）候选（xuǎn）基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的（de）重要连接者（zhě）。在这135个差异候选基因中（zhōng）, 一些基因（yīn） （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病（bìng）程相关（guān）的倾向，表（biǎo）明5hmC和糖尿病（bìng）血管并（bìng）发症之间（jiān）可能存在时间依赖性的相互作用（yòng）。基于纵（zòng）向时间队列的大样（yàng）本（běn）研究，将可进一步明确5hmC变化和糖尿病持续时间之间的（de）动（dòng）态（tài）关（guān）联。关于（yú）单一（yī）并发症（zhèng）和多（duō）种并发症病（bìng）人的159个候选标志基因的功能（néng）注释（shì）研究（jiū）发（fā）现（xiàn），存在细胞-细胞连（lián）接、胶原蛋白形成、新陈代（dài）谢、细胞应激应（yīng）答（dá）信号通路的富集（jí），这些信号通（tōng）路均与细（xì）胞基本功能密切相（xiàng）关（guān）。

血（xuè）管并发症是三分之二糖（táng）尿病病（bìng）人的死亡原因，若能及（jí）早有效控制血管并（bìng）发症的发生，将极大地改善糖尿病病人的（de）生（shēng）存质（zhì）量。该研究建立了一（yī）种利用cfDNA进（jìn）行（háng）2型糖尿病（bìng）血（xuè）管并发症监（jiān）测的无创便捷方法，较（jiào）目前临床标志（zhì）物能更（gèng）准确地监（jiān）控（kòng）血管并发症的（de）发生，从而提示临（lín）床及早采取应对（duì）措施，有效控（kòng）制病情进展。