2019年10月1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研（yán）究（jiū）领域取得重（chóng）要进展（zhǎn）。2型糖（táng）尿病（T2D）的血管并发症是导致2型糖（táng）尿病（bìng）致残致死的重要病因，一直缺乏一种无创便（biàn）捷的临床（chuáng）途（tú）径（jìng）实现血管并发（fā）症的发生发展监测，达到早发（fā）现、早干预（yù），以提高T2D病人的整体生（shēng）活质量，减少卫生经济负担。

该研究入组了62例2型糖尿病病（bìng）人（rén），采（cǎi）用（yòng）5hmC-Seal技术对（duì）血浆（jiāng）cfDNA中表观（guān）遗传标（biāo）志物5hmC的分布（bù）情况进行检测（cè），分析5hmC标志物与（yǔ）2型（xíng）糖（táng）尿病血管并发症发生发展的相关（guān）性。结果表明5hmC标志物（wù）的变化（huà）与T2D合并（bìng）大（dà）血（xuè）管/微血管事（shì）件具有（yǒu）相（xiàng）关性，主要涉及一些与血管（guǎn）生物（wù）学和糖尿病（包括胰岛素（sù）耐受和炎症反应）相关的基因（yīn）和（hé）信号通路。该研究（jiū）建立的（de）16个基因-5hmC标志物组合检（jiǎn）测可以准确区分有并发症和无并发症的2型糖尿病病（bìng）人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于（yú）传统临床（chuáng）变量（liàng）例如白蛋白尿。除（chú）此之外，还建立了13个基因-5hmC标（biāo）志物组合检测，可以进一步区（qū）分T2D合（hé）并单一并发症和多种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样（yàng）明显优（yōu）于其（qí）他传统临床变量。该研究得出结论，5hmC标志物反映了T2D病人大（dà）血管/微（wēi）血管并发症发生（shēng）过（guò）程中的表观遗传变化，因而5hmC-Seal检测技术在（zài）监测（cè）糖尿病血管并发症发生和（hé）进展方（fāng）面具有良好的（de）临床应用前景。

本研究（jiū）共纳入62例2型（xíng）糖尿病病人，包（bāo）括没有血（xuè）管（guǎn）并发（fā）症（zhèng）的病人12例，有单一血管并发症的病人34例（lì）（24例发生大血管事件，10例发生（shēng）微血管（guǎn）事件），以（yǐ）及有多（duō）种（zhǒng）血管并发症（zhèng）的病人16例。试验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序（xù）列，进（jìn）行二代测（cè）序，通过生（shēng）物信息学分析找出并发症（zhèng）组与无并发症组之（zhī）间（jiān）有显著5hmC修（xiū）饰差异（yì）的基因，单一（yī）并发症组和多种并发症组之间有显著5hmC修饰（shì）差异的基因。随（suí）后利用（yòng）回（huí）归模型对差异基因进（jìn）一步筛选、优化，弹性网络进一步筛选，计算（suàn）加（jiā）权平均分，最后得到一组具有高度灵（líng）敏度和（hé）特异性（xìng）的（de）5hmC生物标（biāo）记物（wù），并进一步在实验（yàn）组中验证，分析其灵敏度和（hé）特异（yì）性。并将（jiāng）新（xīn）建立的5hmC标（biāo）志物基（jī）因组合（hé）的检测性能与（yǔ）传统（tǒng）临床变量进行（háng）对比分析。最后对（duì）相关基（jī）因进行了信号通路分析和功能探究（jiū）。

5hmC修饰水（shuǐ）平（píng）与血管并发症具有（yǒu）相关性

利用逻辑（jí）回归模型（xíng）对62例有并发（fā）症和无并发（fā）症2型糖尿病病人的（de）5hmC差异水平进行（háng）分析发现，有并发症2型糖尿病病（bìng）人（rén）的622个差异修饰候（hòu）选（xuǎn）基（jī）因（包（bāo）括上调和（hé）下（xià）调基（jī）因（yīn））的（de）归一（yī）化平均数要明（míng）显高于无并发症的病（bìng）人（P<0.001），但是单一并发症和多发并发症病人之间没有显著（zhe）差异。

之后（hòu）将有单一并发症或（huò）多种并发（fā）症（zhèng）的50例（lì）病人用逻辑回归模型进（jìn）行了（le）对比，发现多种并发症（zhèng）的（de）病人的（de）153个差异修饰候选（xuǎn）基因（包括上调和下调基因）的（de）归（guī）一化平均数要低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标（biāo）志物可区分有无并发症患者

62例2型糖尿病病人被随机分成训练组（n=31）和（hé）测试组（n=31）。利用（yòng）弹性网（wǎng）络筛（shāi）选（xuǎn）后发现（xiàn），16基（jī）因-5hmC标志物组合检测可（kě）以用于区（qū）分有并（bìng）发症和无并（bìng）发症的（de）2型糖尿病病人。

基于16基因组合模型（xíng） (Detection Model 1) 的加权平均分分析，发现无（wú）并发症病人的分数在训练集和测（cè）试（shì）集中都明显低于（yú）有并发症（zhèng）的病人（rén）。只考虑加权平均分的话，受试者工作特征曲线（ROC）分析表明将（jiāng）cutoff值设置成0.5时，在测试（shì）组（zǔ）中中的（de）灵敏（mǐn）度（dù）为（wéi）60%，特异性为（wéi）100%。

5hmC标志（zhì）物可区（qū）分病人（rén）是单一（yī）并发症还是（shì）多种（zhǒng）并发症

50例有并发症的2型糖尿病病人被随机（jī）分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利（lì）用弹（dàn）性网络筛选后发（fā）现，13基因（yīn）-5hmC标志物组合可（kě）以区分2型糖尿病病人是否发生单一并发症（zhèng）或多种并（bìng）发症。

基于13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多种并发症的加权平均分，发现在（zài）训（xùn）练集和测试集中单（dān）一并发症和多种并发症病人的分（fèn）数都有明显差异。值（zhí）得一提的是（shì），有肾病并发症和无肾病并发（fā）症病人的分数也有明显差异。利用（yòng）加权平均分作为判断标准的受试者工作特征曲线（ROC）表明，在测试组中当将（jiāng）cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与传统临床变量/危险因子的（de）对比

我们评估（gū）了不（bú）同临床变量（liàng）/危险因子（zǐ）用于监测（cè）血管并（bìng）发症的（de）灵（líng）敏度和（hé）特异（yì）性（见表1）。

信号（hào）通路分析和功能探究（jiū）

有（yǒu）并发症和（hé）无并发症病人的135个（gè）差异候选基因的功能注释分析表（biǎo）明，这些基因主要（yào）富集在一些经典（diǎn）的信号通路。错误发现（xiàn）率相关P值位于（yú）前10%和基因数目≥3的信号通路包括（kuò）由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通（tōng）路。由IGF1R和IL-10介（jiè）导（dǎo）的信号通路与胰岛素抵抗及炎症反应相关，在血管生物学和糖（táng）尿（niào）病（bìng）发生发展过程中发挥重要作（zuò）用。

Reactome相互（hù）作用网（wǎng）络的中心（xīn）表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛（fàn）素C (UBC)，泛素A-52亚（yà）基核（hé）糖体（tǐ）蛋白融合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在（zài）这（zhè）135个（gè）差异候选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相关的（de）倾向，表明5hmC和糖尿病血（xuè）管并发症之间可能存在时间（jiān）依赖（lài）性的（de）相互作用（yòng）。基于纵（zòng）向时（shí）间（jiān）队列（liè）的大样本研究，将可（kě）进一步明确5hmC变化和糖（táng）尿病持（chí）续时间（jiān）之间的动态关联。关于单一并发症和多种并发（fā）症病人的159个候选标志基因的功能注（zhù）释研究发（fā）现，存在细胞-细胞连（lián）接、胶原蛋白形成、新陈代谢、细胞应激应答信号通路的富集，这些（xiē）信号通路均与（yǔ）细胞基本（běn）功能密切相关。

血（xuè）管（guǎn）并发症是三分之二糖尿病病人的死亡原因（yīn），若能及早（zǎo）有效控制（zhì）血（xuè）管并（bìng）发症（zhèng）的发生，将极大地改善糖尿病病人的生（shēng）存质量。该研究建立了一种（zhǒng）利用cfDNA进行（háng）2型糖尿（niào）病血管并发（fā）症监测的无创（chuàng）便捷方（fāng）法，较目前临床标志物能更准确地（dì）监（jiān）控血管（guǎn）并发（fā）症的发生，从（cóng）而提示临床及早采取应对措（cuò）施，有效控制病情进（jìn）展。